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肠杆菌肽对猪肠道菌群连续培养模型的影响

时间:2022-05-22 浏览:1452次

肠杆菌肽对猪肠道菌群连续培养模型的影响

详细说明




导读




沙门氏菌流行性的增加以及猪对抗生素耐药性增加促使人们寻找抗生素的替代品。肠杆菌肽(MccJ25)是一种由大肠杆菌产生的抗菌肽,对包括肠道沙门氏菌在内的几种病原菌都有很强的抑制作用。


本研究旨在体外评价肠杆菌肽对猪结肠微生物区系组成和代谢活性的影响。以天然存在于人和动物的胃肠道中的罗伊氏乳杆菌与抗生素利福平进行对比试验。使用Illumina MiSeq技术对16S rRNA进行测序以评估微生物多样性,并使用液-质联用(LC-MS)和196体育平台分析来评估抗生素降解产物和监测猪结肠微生物区系代谢组的变化。


结果表明,肠杆菌肽和罗伊氏乳杆菌处理只引起猪结肠微生物区系微生物多样性和代谢组的细微变化,而利福平引起氨基酸水平的显著改变。尽管这些发现需要在体内进行验证,但考虑到肠杆菌肽对病原体的选择性和强大的抑制活性,这项研究为考虑肠杆菌肽作为兽医和农业应用中抗生素的可能替代品提供了第一个概念证明。




肠杆菌肽对猪肠道菌群连续培养模型的影响

Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model



由于国际市场的不断扩大,生猪生产已成为增长最快的产业之一。2019年,猪肉是全球第二大消费肉类,占肉类总产量的32.6%。尽管如此,养猪业近年来遭受了重大损失,主要原因是细菌感染率不断上升。沙门氏菌会引起急性疾病,导致死亡率增加和生产力下降。猪是肠道沙门氏菌的主要宿主,沙门氏菌感染与猪只的腹泻密切相关。许多沙门氏菌血清型已被证明与猪的慢性溃疡性结肠炎或坏死性小肠结肠炎有关。因此,在养猪场,特别是在工业化国家,控制沙门氏菌感染在很大程度上是通过使用抗生素实现的。


抗生素被广泛应用于人类和兽医以及家畜生产中,以治疗细菌性疾病和促进动物生长。它们在养猪生产中用作生长促进剂是常见的,并对提高牲畜生产力和降低生产成本做出了重大贡献。然而,它们的过度使用导致了多种抗药性细菌的出现。这引起了公众的关注,并导致几个国家禁止在动物饲料中使用抗生素作为生长促进剂。现在迫切需要有效替代常规抗生素,以维持猪群健康和生产力。到目前为止提出的最有希望的替代品是由细菌产生的天然抗菌肽。


抗菌肽是由细菌产生的,其分子质量通常小于10 kDa。与常用的广谱抗生素不同,抗菌肽是从mRNA翻译而来的,其活性谱很窄,在纳摩尔浓度下抑制相同或密切相关物种的菌株。抗菌肽可广泛应用于农业食品、人类和兽医等领域。肠杆菌肽(MccJ25)是研究最多的抑制革兰氏阴性菌的抗菌肽之一。它具有典型的套索结构,这种高度紧凑的结构使肠杆菌肽对变性条件、高温、极端酸碱性和某些蛋白酶具有显著的稳定性。添加肠杆菌肽的日粮已被证明可以改善断奶仔猪的生长性能,减轻腹泻和全身炎症。伴随着大肠杆菌减少,乳杆菌和双歧杆菌种类的增加,提高了短链脂肪酸(SCFA)的含量。


在本研究中,我们使用PolyFermS连续发酵模型模拟猪近端结肠,在体外评价肠杆菌肽对猪结肠微生物区系组成和代谢活性的影响。将肠杆菌肽与广谱常规抗生素利福平、罗伊氏乳杆菌进行了比较。此外,我们通过研究这三种抗菌化合物的降解产物,探究它们对猪结肠微生物区系代谢的影响。









01 研究方法


采用PolyFermS体外连续发酵模型,采用改良的Macfarlane培养基模拟猪近端结肠。在35天的发酵过程中,含有固定化猪粪便微生物群的第一阶段反应器与两个第二阶段控制和测试反应器并行运行,测试肠杆菌肽对微生物群组成和代谢活性的影响。以天然存在于人和动物的胃肠道中的罗伊氏乳杆菌与抗生素利福平进行对比试验。使用Illumina MiSeq技术对16S rRNA进行测序以评估微生物多样性,并使用液-质联用(LC-MS)和196体育平台分析来评估细菌素/抗生素降解产物和监测猪结肠微生物区系代谢组的变化。


图1:连续发酵实验的实验装置。

(A)由一个接种反应堆和两个试验反应堆组成的PolyFermS模型概述。IR:固定化猪粪细菌的接种反应器(30%v/v);TR1、TR2:试验生物反应器;S:稳定期;T:处理期;W:洗涤期。

(B)实验处理和样本收集时间表。










02 研究结果


2.1
肠杆菌肽、罗伊氏乳杆菌和利福平对结肠菌群的影响


根据PMA-qPCR分析,在加入沙门氏菌和抗菌药物后的前12小时内,试验反应器中特定菌群数量在总体组成上保持相对稳定。然而,利福平对总细胞和拟杆菌的数量有诱导作用,直到发酵结束,除了乳酸菌科外,这些细菌群重新生长。在发酵12小时后,单独用沙门氏菌处理也观察到类似的效果,特别是对乳酸菌数量的影响。相比之下,罗伊氏乳杆菌和肠杆菌肽对细菌总数没有显著影响。


2.2
肠杆菌肽、罗伊氏乳杆菌和利福平对猪肠道微生物区系多样性的影响


通过对16S rRNA基因的测序,评估了受试抗菌剂对微生物区系组成的影响。沙门氏菌处理和罗伊氏乳杆菌处理组没有检测到微生物组成的显著变化,这表明这些处理对24小时发酵过程中测得的总体微生物区系组成没有影响。另一方面,与沙门氏菌相比,肠杆菌肽和利福平有显著差异(p=0.001)。


利用香农指数和asv聚类,通过α多样性研究了处理对猪肠道微生物区系的影响(图2)。结果表明,在发酵结束前的8h,利福平处理后的α多样性显著降低,证实了利福平对微生物区系组成具有影响。在结肠发酵结束时,沙门氏菌组α多样性下降,但并不显著;肠杆菌肽和罗伊氏乳杆菌处理组在发酵过程中没有引起阿尔法多样性的显著变化。


图2:用16S rRNA基因扩增序列测序法测定沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠杆菌肽(MccJ25)、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)合用对猪肠微生物区系的影响。


通过门水平的分类分析,进一步评估了受试抗菌剂对猪肠道微生物区系组成的影响。结果表明,利福平处理导致了变形杆菌和菌门变形杆菌的相对丰度增加(图3)。


图3:沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠杆菌肽(MccJ25)、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)联合接种后,猪微生物区系基于16S rRNA基因的微生物群落结构。


此外,从8小时开始,利福平对大肠杆菌(ASV002)的相对丰度显著增加(12小时的相对丰度超过44%)(图4)。



图4:沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠杆菌肽(MccJ25)、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)联合接种对猪肠微生物区系的影响。


这些数据表明,与其他测试的抗菌剂相比,利福平显著影响微生物区系组成,会影响肠道微生物区系的代谢活动。


2.3
高效液相色谱与质谱学数据分析和代谢组谱的联用


用LC-MS分析发酵液颗粒提取物,以评价肠杆菌肽、罗伊氏乳杆菌和利福平对猪结肠微生物区系代谢的影响。如图5所示,肠杆菌肽和利福平对代谢组学的影响最大,但肠杆菌肽的作用随着时间的推移而降低,而利福平的作用则增加(图5B)。处理24 h后,肠杆菌肽处理组的代谢组学特征与试验前接近。相比之下,利福平对猪结肠微生物区系代谢组有显著影响,且随时间延长而增加。


图5:PolyFermS模型中猪结肠微生物区系的代谢组谱。

(A)通过LC-MS获得的每个处理的基峰色谱图。

(B)从LC-MS数据获得的PCA计分图(左:PC1与PC2,右:PC1与PC3)。









03 结论


由于肠杆菌肽对病原菌的选择性、强大的抑制活性、稳定性以及它引起的微生物区系组成的细微变化,肠杆菌肽可能被认为是养猪领域中可能的抗生素替代品。


参考文献:Naimi S, Zirah S, Greppi A, Lacroix C, Rebuffat S, Fliss I. Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model. Front Microbiol




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